酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）作為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的“金標準”技術(shù)，通過抗原抗體特異性結(jié)合與酶催化顯色反應(yīng)，實現(xiàn)對蛋白質(zhì)、激素、細胞因子等生物分子的高靈敏度定量檢測。其核心原理基于抗原與抗體的“鎖鑰”識別機制，結(jié)合酶催化底物顯色的信號放大效應(yīng)，將微量生物分子轉(zhuǎn)化為可量化的光學(xué)信號。

　　一、elisa實驗步驟：從包被到顯色的精密操作

　　1.包被抗原/抗體

　　將特異性捕獲抗體或抗原用碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）稀釋至1-10μg/mL，加入96孔酶標板中，每孔100μL，4℃孵育過夜或37℃孵育2小時。此步驟使抗原/抗體通過疏水作用固定于固相載體表面，形成捕捉層。

　　2.封閉非特異性結(jié)合位點

　　加入5% BSA或脫脂奶粉封閉液，每孔200μL，室溫孵育1-2小時，以減少后續(xù)步驟中非特異性吸附導(dǎo)致的背景噪聲。

　　3.加樣與孵育

　　將待測樣本稀釋至適當(dāng)濃度（如1:100），每孔加入100μL，37℃孵育1-2小時。樣本中的目標分子與固相載體上的捕獲抗體/抗原特異性結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物。

　　4.酶標抗體結(jié)合

　　加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體，每孔100μL，37℃孵育1小時。該抗體與目標分子的另一表位結(jié)合，形成“夾心”結(jié)構(gòu)。

　　5.顯色與終止

　　加入TMB顯色液，每孔100μL，室溫避光孵育10-30分鐘。HRP催化TMB氧化生成藍色產(chǎn)物，加入2M硫酸終止反應(yīng)后，溶液轉(zhuǎn)為黃色。

　　6.結(jié)果讀取

　　使用酶標儀在450nm波長下測定吸光度值（OD值），繪制標準曲線并計算樣本濃度。

　　二、技術(shù)亮點：高靈敏度與高特異性的雙重保障

　　ELISA的靈敏度可達皮摩爾級別，這得益于酶催化反應(yīng)的信號放大效應(yīng)。例如，在雙抗體夾心法中，單個目標分子可結(jié)合多個酶標抗體，顯著提升顯色強度。其特異性則源于抗原抗體的精準識別，通過優(yōu)化抗體對的選擇與孵育條件，可有效避免交叉反應(yīng)。
 

　　三、應(yīng)用場景：從臨床診斷到科研探索

　　ELISA廣泛應(yīng)用于病毒抗原檢測（如新冠病毒IgM/IgG抗體）、藥物殘留篩查（如牛奶中青霉素殘留）及細胞因子定量（如IL-6在炎癥研究中的應(yīng)用）。其高通量、低成本的特性，使其成為生物醫(yī)學(xué)研究至關(guān)重要的工具。

　　從包被到顯色，ELISA的每一步操作均需嚴格遵循科學(xué)規(guī)范。唯有如此，方能將這一技術(shù)轉(zhuǎn)化為推動生命科學(xué)進步的可靠力量。